Loading...

Визуализация электрических явлений

Все клетки животных окружены клеточной мембраной, состоящей из двойного слоя липидов с встроенными в него белками, как показано на рисунке 1. Стандартное электричество (например, в вашем доме) в основном связано с движением электронов; но электрофизиология включает в себя движение ионов (атомов, имеющих заряд). В организме наиболее распространенными ионами являются натрий (Na +), калий (K +), кальций (Ca2 +) и хлор (Cl–). Область внутри клеток (цитозоль) и снаружи клеток заполнена миллионами ионов, а клеточная мембрана контролирует движение ионов внутрь и наружу.

Это движение ионов через мембрану можно измерить, и это приведет к изменениям напряжения. Эти изменения отмечаются индикаторами напряжения, и отображение этих красителей известно как отображение напряжения.


Индикаторы напряжения

Постоянное присутствие градиентов концентрации ионов на мембране приводит к разнице в напряжении внутри и снаружи клетки. Это называется мембранным потенциалом и обычно составляет от –40 мВ до -80 мВ. Для большинства клеток мембранный потенциал стабилен при этих типичных значениях, которые также называют потенциалом покоя.

 

Рисунок 1: Клеточная мембрана. А) Типичная клетка полностью окружена мембраной, а объекты и события внутри и вне клеточной мембраны называются внутриклеточными и внеклеточными соответственно. Б) Увеличенное изображение клеточной мембраны, которая состоит из двух слоев фосфолипидов, расположенных головками снаружи и хвостами внутри. C) В клеточную мембрану встроены белки, жиры и углеводы, при этом некоторые белки находятся только в одной половине мембраны, а некоторые полностью пересекают мембрану и служат каналом. Источник изображения: https://open.oregonstate.education/aandp/chapter/3-1-the-cell-membrane/

 

Индикаторы напряжения (VIs) - это вещества, которые изменяются в ответ на изменение напряжения. Обрабатывая культуры клеток мозга или сердца с помощью VIs, можно наблюдать и измерять их вольт-амперную активность. Большое количество процессов в организме сопровождается изменениями мембранного потенциала, например, нейроны мозга, передающие сигналы друг другу, и миоциты сердца, регулирующие сердцебиение.

Визуализация с помощью VIs (визуализация напряжения) позволяет получать прямую флуоресцентную визуализацию изменений напряжения, привлекательный метод для изучения нейронных цепей и сердечной мышцы и полезное дополнение к традиционным методам на основе электродов или визуализации кальция.

Однако есть несколько недостатков, которые означают, что визуализация напряжения не так широко распространена, как другие электрофизиологические методы:

  1. Передача нейронных сигналов очень быстрая (~ 1 мс), и любая VI должна реагировать даже быстрее (менее миллисекунды), чтобы наилучшим образом разрешить изображение.
  2. В то время как визуализация кальция может использовать любой поток ионов кальция через клетку, визуализация напряжения должна быть локализована на клеточной мембране, чтобы функционировать.

Это означает, что проектирование VI является более сложной задачей, поскольку они не будут функционировать, если не смогут локализоваться на мембране, и только ограниченное количество молекул красителя получит полезный сигнал, поскольку мембрана имеет небольшой объем по сравнению с внутренним и внешним. ячейки. Комбинация этих двух факторов (быстрые биологические события и небольшие рабочие объемы) означает, что VI должны быть яркими, стабильными, высокочувствительными и не нарушать нормальную активность клеток. Несмотря на это, визуализация напряжения была частью электрофизиологии в течение почти 40 лет, и за это время был разработан ряд жизнеспособных VIs.


Красители, чувствительные к напряжению

Самые ранние ВИ были небольшими молекулами флуоресцентного красителя, обнаруженными после того, как Ларри Коэн и его коллеги проверили тысячи красителей для поиска красителей, чувствительных к напряжению (VSD). Первым был мероцианин 540, который проявлял чувствительную к напряжению флуоресценцию и использовался для отслеживания передачи сигналов у гигантского кальмара, и с тех пор был обнаружен ряд других VSD. Эти VSD связываются с мембранами клеток и изменяют свою флуоресценцию при изменении потенциала клеточной мембраны.

VSDs можно в общих чертах разделить на две категории: медленные красители и быстрые красители. Медленные красители реагируют на изменения мембранного потенциала от миллисекунд до секунд и поэтому лучше всего подходят для измерения потенциала покоя больших групп клеток, поскольку они не могут измерить быстрое нейронное взаимодействие. Быстродействующие красители реагируют за микросекунды и пропорционально изменению мембранного потенциала, что делает их намного более быстрыми и поддающимися количественной оценке, но часто имеют низкую чувствительность.

И медленные, и быстрые красители нашли свое применение, но дальнейшие разработки VSDs привели к появлению более современных методов, таких как фотоиндуцированный перенос электронов (PET). Этот метод включает в себя передачу электронов от молекулярного провода к VI, этот процесс чувствителен к внешним электрическим полям (и, следовательно, к мембранному потенциалу), но при этом очень быстр и имеет скорость, достаточную для захвата нейронной связи.

Несмотря на эти достижения, VSDs ограничены из-за их неспособности воздействовать на конкретные популяции нейронов и помех сигналу от неактивных клеток или нежелательных активных клеток. Кроме того, VSDs реагируют ненадежно и часто требуют многочисленных повторений и шагов оптимизации, а краситель может вызывать необратимые изменения в клетках, которые обрабатываются VSDs, даже изменяя фотодинамику. Более совершенный VI будет обладать способностью специфически воздействовать на субпопуляции клеток или даже белки внутри клеток, такие как белки мембранного канала или другие единицы, связанные с мембранным потенциалом. Этот прогресс проявляется в виде флуоресцентных белков.


Индикаторы напряжения с генетической кодировкой

Флуоресцентные белки (FP), такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), произвели революцию в области биологической визуализации, позволив органическим белкам, которые встречаются в природе, флуоресцентно маркировать любой белок, клеточный компонент или комплекс неинвазивным, быстрым и чувствительным образом. Что касается изображения напряжения, в 1997 году Искафф и Сигель объединили GFP с мембранным калиевым каналом, создав первый чувствительный к напряжению флуоресцентный белок, названный FlaSh. Эти индикаторы обычно называют генетически закодированными индикаторами напряжения (GEVI).

Фактически, слияние FP с любым белком, который претерпевает изменение конформационной формы в ответ на изменения концентрации ионов кальция или мембранного потенциала, создает жизнеспособный VI. Эти индикаторы на основе FP закодированы в ДНК и могут быть выражены любой клеткой после некоторой генной инженерии, что означает, что визуализация напряжения может быть выполнена на крупных живых животных или срезах тканей. Исследователи объединили GFP с широким спектром компонентов ячеек, связанных с напряжением, в результате чего получили три поколения GEVI.

Первое поколение состояло из оригинального FlaSh и других GEVI, в которых GFP был слит с калиевым или натриевым каналом, таких как VSFP1 (2001) и SPARC (2002). Это первое поколение имеет плохое нацеливание на клеточную мембрану и низкую экспрессию, но заложило основы для GEVI.

Второе поколение было основано на открытии белка (Ci-VSP), который имел один домен, чувствительный к напряжению, в отличие от предыдущих натриевых / калиевых каналов, у которых было четыре, и мог функционировать сам по себе изолированно. Это позволило использовать гораздо более простые GEVI, которые лучше нацелены на плазматическую мембрану, такие как VSFP2 (2007-2009), которые также могут использовать несколько разных цветов FP (желтый, красный, голубой), чтобы можно было использовать несколько индикаторов одновременно. Недостатком было то, что эти GEVI медленно реагировали на изменения мембранного потенциала.

Третье поколение было похоже на второе, но включало гораздо более сильную связь между доменом, чувствительным к напряжению, и FP с более коротким линкерным участком, и включало использование только одного FP, а не нескольких. Это сделало их намного более быстрыми и способными разрешать быструю передачу нейронных сигналов, но ограничивалось только одним цветом.

 

Рисунок 2: Различные ВП на основе FP в нейронах гиппокампа. Зеленым цветом обозначены индикаторы второго поколения, голубым - индикатор третьего поколения. Пунктирные белые прямоугольники увеличиваются и отображаются рядом с изображением. Белые стрелки показывают локализацию, некоторые локализуются на мембране и / или внутриклеточно. Изображения адаптированы из Perron et al. (2009).


Опсины

Вместо слияния FP с белками, связанными с напряжением, другой вариант включает в себя естественно светочувствительные канальные белки из семейства белков опсина (например, родопсин, белок, который позволяет нашим глазам обнаруживать свет). Один бактериальный опсин (творчески названный бактериородопсином) широко используется в оптогенетике, где свет используется для индукции конформационных изменений в белке канала, включая и выключая клетки с помощью света. В 2011 году Ларри Коэн и его коллеги нашли способ обратить этот процесс вспять, когда изменение мембранного потенциала изменило конформацию канала, что затем изменило флуоресценцию опсина.

Эти GEVI на основе опсина обладают высокой чувствительностью к изменениям напряжения и быстро активны, но также требуют достаточно интенсивного света для достижения флуоресценции, а это означает, что у клеток есть шанс развить фотоповреждения. Тем не менее, опсиновые GEVI не могут быть надежной платформой для изучения, поскольку несколько итераций разных GEVI созданы из небольших настроек генетического кода, что приводит к повышению яркости и снижению начального светового возбуждения.

Кроме того, GEVI на основе опсина были дополнительно объединены с дополнительными FP для создания GEVI пары FRET Opsin-FP, где FRET - это резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET), а именно то, как две флуоресцентные молекулы могут обмениваться энергией, когда они находятся достаточно близко друг к другу (в пределах ~ 10 нм). Это обеспечивает большую гибкость при выборе датчика напряжения и оптического репортера, поскольку изменения мембранного потенциала изменяют спектр опсина и вызывают удобный сигнал для мониторинга напряжения.

 

Рисунок 3: Четыре типа индикатора напряжения. A) Маломолекулярные VSD прикрепляются к клеточной мембране и изменяют флуоресценцию в ответ на изменения мембранного потенциала. B) FP, слитые с канальными белками с доменами, чувствительными к напряжению, флуоресценция изменяется в зависимости от мембранного потенциала. C) Опсины, флуоресценция которых естественным образом изменяется при изменении мембранного потенциала. D) Пары Opsin-FP, которые могут выполнять FRET, что позволяет настраивать GEVI.


Камеры для визуализации напряжения

Визуализация напряжения - это приложение с очень высокими скоростями, а это означает, что высокоскоростная sCMOS камера наиболее подходит для визуализации напряжения, чтобы наилучшим образом захватывать и количественно определять быстро изменяющиеся сигналы. Поскольку это изображение может происходить через большие ткани или между отдельными клетками, лучше всего согласовать размер пикселя камеры с увеличением и полем зрения в эксперименте, чтобы разрешить по Найквисту и получить лучшие изображения.

Photometrics Kinetix

Photometrics Moment

Teledyne Photometrics Evolve


Резюме

Визуализация напряжения - это самостоятельный мощный и гибкий метод. Постоянный прогресс в области визуализации напряжения от небольших молекул VSD до GEVI с парой FRET привел к тому, что визуализация напряжения часто превосходит более инвазивные традиционные методы, такие как записи на основе электродов. Современная визуализация напряжения может отображать клеточные сигналы с субклеточным пространственным разрешением и быстрым временным разрешением, достаточным для соответствия передаче сигналов нервных клеток. Что касается скорости, изображение напряжения намного быстрее, чем изображение кальция, и использовалось во многих экспериментах на живых клетках и крупных модельных организмах.

В целом, визуализация напряжения - важная часть электрофизиологии, которая со временем постоянно совершенствуется и, вероятно, продолжит играть большую роль в далеком будущем.

 

Использованная литература

Перрон А., Муто Х., Акеманн В., Гаутам С. Г., Димитров Д., Ивамото Ю. и Кнёпфель Т. (2009). Чувствительные к напряжению флуоресцентные белки второго и третьего поколения для мониторинга мембранного потенциала. Front. Mol. Neurosci.2:5. doi: 10.3389 /neuro.02.005.2009

Нажимая кнопку "Отправить", я даю согласие на обработку моих Персональных данных.